I metodi di rilevamento molecolare hanno la capacità di produrre un grande volume di acido nucleico attraverso l'amplificazione di tracce presenti nei campioni.Sebbene ciò sia utile per consentire un rilevamento sensibile, introduce anche la possibilità di contaminazione attraverso la diffusione di aerosol di amplificazione nell'ambiente di laboratorio.Quando si eseguono esperimenti, è possibile adottare misure per evitare la contaminazione di reagenti, attrezzature di laboratorio e spazio sul banco, in quanto tale contaminazione può generare risultati falsi positivi (o falsi negativi).

Per contribuire a ridurre la probabilità di contaminazione, è necessario esercitare sempre la buona pratica di laboratorio.In particolare, devono essere prese precauzioni riguardo ai seguenti punti:

1. Manipolazione dei reagenti
2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature
3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato
4. Consigli generali di biologia molecolare
5. Controlli interni
6. Bibliografia

1. Manipolazione dei reagenti

Centrifugare brevemente le provette dei reagenti prima dell'apertura per evitare la generazione di aerosol.Aliquotare i reagenti per evitare più congelamenti e scongelamenti e la contaminazione dei master stock.Etichettare e datare chiaramente tutti i reagenti e le provette di reazione e conservare i registri dei numeri di lotto e di lotto dei reagenti utilizzati in tutti gli esperimenti.Pipettare tutti i reagenti e i campioni utilizzando i puntali con filtro.Prima dell'acquisto, è consigliabile verificare con il produttore che i puntali con filtro siano adatti alla marca della pipetta da utilizzare.

2. Organizzazione dello spazio di lavoro e delle attrezzature

Lo spazio di lavoro dovrebbe essere organizzato per garantire che il flusso di lavoro avvenga in una direzione, dalle aree pulite (pre-PCR) alle aree sporche (post-PCR).Le seguenti precauzioni generali contribuiranno a ridurre la possibilità di contaminazione.Avere stanze designate separate, o almeno aree fisicamente separate, per: preparazione della mastermix, estrazione dell'acido nucleico e aggiunta del templato di DNA, amplificazione e manipolazione del prodotto amplificato e analisi del prodotto, ad es. elettroforesi su gel.

In alcuni contesti avere 4 stanze separate è difficile.Un'opzione possibile ma meno desiderabile è quella di eseguire la preparazione della mastermix in un'area di contenimento, ad esempio una cappa a flusso laminare.Nel caso dell'amplificazione PCR nidificata, la preparazione della mastermix per la reazione del secondo ciclo deve essere preparata nell'area "pulita" per la preparazione della mastermix, ma l'inoculazione con il prodotto PCR primario deve essere effettuata nella sala di amplificazione e, se possibile, in un'area di contenimento dedicata (es. cappa a flusso laminare).

Ogni stanza/area necessita di un set separato di pipette, puntali con filtro, rack per provette, vortici, centrifughe (se pertinente), penne, reagenti di laboratorio generici, camici e scatole di guanti chiaramente etichettati che rimarranno nelle rispettive postazioni di lavoro.Le mani devono essere lavate e guanti e camici cambiati quando ci si sposta tra le aree designate.I reagenti e le apparecchiature non devono essere spostati da un'area sporca a un'area pulita.Nel caso in cui si verifichi un caso estremo in cui un reagente o un componente dell'apparecchiatura debba essere spostato all'indietro, deve prima essere decontaminato con ipoclorito di sodio al 10%, seguito da una pulizia con acqua sterile.

Nota

La soluzione di ipoclorito di sodio al 10% deve essere preparata fresca giornalmente.Se utilizzato per la decontaminazione, deve essere rispettato un tempo minimo di contatto di 10 minuti.
In alternativa, è possibile utilizzare prodotti disponibili in commercio convalidati come decontaminanti superficiali che distruggono il DNA se le raccomandazioni di sicurezza locali non consentono l'uso di ipoclorito di sodio o se l'ipoclorito di sodio non è adatto per la decontaminazione delle parti metalliche dell'apparecchiatura.

Idealmente, il personale dovrebbe attenersi all'etica del flusso di lavoro unidirezionale e non tornare dalle aree sporche (post-PCR) alle aree pulite (pre-PCR) nello stesso giorno.Tuttavia, ci possono essere occasioni in cui ciò è inevitabile.Quando si presenta tale occasione, il personale deve aver cura di lavarsi accuratamente le mani, cambiare i guanti, indossare il camice da laboratorio designato e non introdurre alcuna attrezzatura che vorrebbe portare fuori dalla stanza, come i libri di laboratorio.Tali misure di controllo dovrebbero essere enfatizzate nella formazione del personale sui metodi molecolari.

Dopo l'uso, gli spazi del banco devono essere puliti con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da acqua sterile per rimuovere la candeggina residua), etanolo al 70% o un decontaminante per la distruzione del DNA convalidato disponibile in commercio.Idealmente, le lampade ultraviolette (UV) dovrebbero essere installate per consentire la decontaminazione mediante irraggiamento.Tuttavia, l'uso di lampade UV dovrebbe essere limitato ad aree di lavoro chiuse, ad esempio armadi di sicurezza, al fine di limitare l'esposizione ai raggi UV del personale di laboratorio.Si prega di attenersi alle istruzioni del produttore per la cura, la ventilazione e la pulizia delle lampade UV al fine di garantire che le lampade rimangano efficaci.

Se si utilizza etanolo al 70% anziché ipoclorito di sodio, sarà necessaria l'irradiazione con luce UV per completare la decontaminazione.
Non pulire il vortex e la centrifuga con ipoclorito di sodio;invece, pulire con etanolo al 70% ed esporre alla luce UV o utilizzare un decontaminante commerciale che distrugge il DNA.In caso di fuoriuscite, consultare il produttore per ulteriori consigli sulla pulizia.Se le istruzioni del produttore lo consentono, le pipette devono essere regolarmente sterilizzate in autoclave.Se le pipette non possono essere sterilizzate in autoclave, dovrebbe essere sufficiente pulirle con ipoclorito di sodio al 10% (seguito da un'accurata pulizia con acqua sterile) o con un decontaminante commerciale che distrugge il DNA seguito dall'esposizione ai raggi UV.

La pulizia con ipoclorito di sodio ad alta percentuale può eventualmente danneggiare la plastica e i metalli delle pipette se eseguita regolarmente;controllare prima le raccomandazioni del produttore.Tutte le apparecchiature devono essere calibrate regolarmente secondo il programma consigliato dal produttore.Una persona designata dovrebbe essere incaricata di garantire il rispetto del programma di calibrazione, la conservazione di registri dettagliati e la visualizzazione chiara delle etichette di servizio sull'apparecchiatura.

3. Consigli per l'uso e la pulizia dello spazio molecolare designato

Pre-PCR: aliquotazione del reagente/preparazione della mastermix: questo dovrebbe essere lo spazio più pulito di tutti utilizzato per la preparazione di esperimenti molecolari e idealmente dovrebbe essere una cappa a flusso laminare designata dotata di una luce UV.Campioni, acido nucleico estratto e prodotti PCR amplificati non devono essere manipolati in quest'area.I reagenti di amplificazione devono essere conservati in un congelatore (o frigorifero, secondo le raccomandazioni del produttore) nello stesso spazio designato, idealmente accanto alla cappa a flusso laminare o all'area pre-PCR.I guanti devono essere cambiati ogni volta che si entra nell'area pre-PCR o nella cappa a flusso laminare.

L'area pre-PCR o la cappa a flusso laminare deve essere pulita prima e dopo l'uso come segue: pulire tutti gli elementi nella cappa, ad es. pipette, puntali, vortex, centrifughe, rack per provette, penne, ecc. decontaminante commerciale in grado di distruggere il DNA e lasciare asciugare.Nel caso di un'area di lavoro chiusa, ad esempio una cappa a flusso laminare, esporre la cappa alla luce UV per 30 minuti.

Nota

Non esporre i reagenti alla luce UV;spostarli nell'armadietto solo quando è pulito.Se si esegue la PCR a trascrizione inversa, può anche essere utile pulire le superfici e le attrezzature con una soluzione che scompone le RNasi al contatto.Questo può aiutare a evitare risultati falsi negativi dalla degradazione enzimatica dell'RNA.Dopo la decontaminazione e prima di preparare il mastermix, i guanti devono essere cambiati ancora una volta, dopodiché l'armadio è pronto per l'uso.

Pre-PCR: estrazione dell'acido nucleico/aggiunta del modello:

L'acido nucleico deve essere estratto e maneggiato in una seconda area designata, utilizzando un set separato di pipette, puntali con filtro, rack per provette, guanti puliti, camici da laboratorio e altre attrezzature. Quest'area serve anche per l'aggiunta di modelli, controlli e linee di tendenza al provette o piastre mastermix.Per evitare la contaminazione dei campioni di acido nucleico estratti che vengono analizzati, si consiglia di cambiare i guanti prima di maneggiare controlli positivi o standard e di utilizzare un set separato di pipette.I reagenti PCR ei prodotti amplificati non devono essere pipettati in quest'area.I campioni devono essere conservati in frigoriferi o congelatori designati nella stessa area.Lo spazio di lavoro campione deve essere pulito allo stesso modo dello spazio mastermix.

Post-PCR: Amplificazione e manipolazione del prodotto amplificato

Questo spazio designato è per i processi post-amplificazione e dovrebbe essere fisicamente separato dalle aree pre-PCR.Di solito contiene termociclatori e piattaforme in tempo reale e, idealmente, dovrebbe avere una cabina a flusso laminare per aggiungere il prodotto PCR del round 1 alla reazione del round 2, se viene eseguita la PCR nidificata.I reagenti PCR e l'acido nucleico estratto non devono essere manipolati in quest'area poiché il rischio di contaminazione è elevato.Quest'area dovrebbe avere un set separato di guanti, camici da laboratorio, rack per piastre e provette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature.Le provette devono essere centrifugate prima dell'apertura.Lo spazio di lavoro campione deve essere pulito allo stesso modo dello spazio mastermix.

Post-PCR: analisi del prodotto

Questa stanza è destinata alle apparecchiature di rilevamento del prodotto, ad esempio serbatoi per elettroforesi su gel, alimentatori, transilluminatore UV e sistema di documentazione del gel.Quest'area dovrebbe avere set separati di guanti, camici da laboratorio, rack per piastre e provette, pipette, puntali con filtro, contenitori e altre attrezzature.Nessun altro reagente può essere introdotto in quest'area, ad eccezione del colorante di caricamento, del marcatore molecolare e del gel di agarosio e dei componenti tampone.Lo spazio di lavoro campione deve essere pulito allo stesso modo dello spazio mastermix.

Nota importante

Idealmente, le sale pre-PCR non dovrebbero essere inserite lo stesso giorno se il lavoro è già stato svolto nelle sale post-PCR.Se ciò è del tutto inevitabile, assicurarsi che le mani vengano prima lavate accuratamente e che nelle stanze siano indossati specifici camici da laboratorio.Libri e documenti di laboratorio non devono essere portati nelle sale pre-PCR se sono stati utilizzati nelle sale post-PCR;se necessario, eseguire stampe duplicate di protocolli/ID campione, ecc.

4. Consigli generali di biologia molecolare

Utilizzare guanti senza polvere per evitare l'inibizione del test.Una corretta tecnica di pipettaggio è fondamentale per ridurre la contaminazione.Un pipettaggio errato può provocare schizzi durante l'erogazione di liquidi e la creazione di aerosol.Le buone pratiche per un pipettaggio corretto sono disponibili ai seguenti link: guida Gilson al pipettaggio, video sulla tecnica di pipettaggio Anachem, provette da centrifuga prima dell'apertura e aprirle con attenzione per evitare schizzi.Chiudere le provette immediatamente dopo l'uso per evitare l'introduzione di contaminanti.

Quando si eseguono reazioni multiple, preparare una mastermix contenente reagenti comuni (ad es. acqua, dNTP, tampone, primer ed enzima) per ridurre al minimo il numero di trasferimenti di reagenti e ridurre il rischio di contaminazione.Si consiglia di allestire il mastermix su ghiaccio o un blocco freddo.L'uso di un enzima Hot Start può aiutare a ridurre la produzione di prodotti non specifici.Proteggere i reagenti contenenti sonde fluorescenti dalla luce per evitare il degrado.

5. Controlli interni

Includere controlli positivi e negativi ben caratterizzati e confermati, insieme a un controllo senza modello in tutte le reazioni e una linea di tendenza titolata multipunto per le reazioni quantitative.Il controllo positivo non deve essere così forte da rappresentare un rischio di contaminazione.Includere controlli di estrazione positivi e negativi quando si esegue l'estrazione dell'acido nucleico.

Si raccomanda di affiggere istruzioni chiare in ciascuna delle aree in modo che gli utenti siano a conoscenza delle regole di condotta.I laboratori diagnostici che rilevano livelli molto bassi di DNA o RNA nei campioni clinici potrebbero voler adottare l'ulteriore misura di sicurezza di disporre di sistemi di trattamento dell'aria separati con pressione dell'aria leggermente positiva nelle sale pre-PCR e pressione dell'aria leggermente negativa nelle sale post-PCR.

Infine, è utile sviluppare un piano di garanzia della qualità (QA).Tale piano dovrebbe includere elenchi di scorte principali di reagenti e scorte di lavoro, regole per la conservazione di kit e reagenti, comunicazione dei risultati dei controlli, programmi di formazione del personale, algoritmi per la risoluzione dei problemi e azioni correttive quando necessario.

6. Bibliografia

Aslan A, Kinzelman J, Dreelin E, Anan'eva T, Lavander J. Capitolo 3: Creazione di un laboratorio qPCR.Un documento guida per testare le acque ricreative utilizzando il metodo USEPA qPCR 1611. Lansing- Michigan State University.

Sanità pubblica Inghilterra, NHS.Standard del Regno Unito per le indagini microbiologiche: buona pratica di laboratorio durante l'esecuzione di analisi di amplificazione molecolare).Guida alla qualità.2013;4(4):1–15.

Mifflin T. Creazione di un laboratorio PCR.Cold Spring Harb Protoc.2007;7.

Schroeder S 2013. Manutenzione ordinaria delle centrifughe: pulizia, manutenzione e disinfezione di centrifughe, rotori e adattatori (Libro bianco n. 14).Amburgo: Eppendorf;2013.

Viana RV, Vallese CL.Good Clinical Laboratory Practice (GCLP) per i test a base molecolare utilizzati nei laboratori diagnostici, In: Akyar I, editore.Ampi spettri di controllo qualità.Fiume, Croazia: Intech;2011: 29–52.